系列研究闡明多能干細胞基因組穩態維持新機理
多能干細胞（Pluripotent stem cells, PSCs）因其在體外具有無限增殖和分化為不同類型細胞的潛能，在再生醫學領域中具有廣泛應用前景，也成為目前臨床上最具潛能的成藥細胞。PSCs制備過程中的標準化、規?；凹毎|量穩定性是其走向臨床應用的先決條件.但人PSCs在體外擴增培養過程中,易出現遺傳和表觀遺傳的變異,嚴重阻礙了PSCs的臨床應用(1)。因此,研究PSCs遺傳物質穩定性維持機理，是尋找改善策略、突破應用瓶頸的關鍵。
PSCs基因組的突變率遠低于分化細胞。鄭萍團隊和其他團隊的前期研究表明，PSCs利用不同于體細胞的特殊機制，有效調控基因組穩定(2)。鄭萍組前期已鑒定了PSCs在DNA復制、DNA損傷修復中的一些特殊分子及作用機制(3-6)。近期鄭萍組鑒定了一個在小鼠胚胎干細胞（mouse Embryonic Stem cells, mESCs）中特異表達的全新長鏈非編碼RNA-LncRNA NONMMUT028956 (簡寫為Lnc956)。對該LncRNA的系統研究發現它不僅參與復制壓力下mESCs復制小體穩定的維持，而且還監控mESCs基因組的質量，從而確保mESCs基因組穩態。
長非編碼RNA在多種生物學功能中起重要作用。由于技術手段的限制，目前還沒有發現復制叉上具有功能性長非編碼RNA的報道。研究團隊利用前期研發的一個新技術-分離新生DNA鏈上(即復制叉)RNA技術（isolate RNAs on nascent DNA?，iROND)首次鑒定了ESCs復制叉上特異的新的功能性LncRNA-Lnc956。對該LncRNA的研究發現，當復制壓力發生時，Lnc956能有效聚集到復制叉上，并大量招募Trim28和Hsp90b1聚集于復制叉形成復合體。Trim28能直接與DNA復制解旋酶復合體MCM2-7相互作用，直接拉近了Lnc956-Trim28-Hsp90b1復合體與MCM2-7復合體之間的物理距離，使得分子伴侶Hsp90b1通過其GTP水解活性作用于MCM7，阻礙MCM7進行K48和K63泛素化（MCM7泛素化會導致復制小體解離），從而使得復制小體能在一定程度復制壓力情況下得以穩定，保持了基因組的完整性（圖1）。我們也發現Lnc956缺失會導致小鼠胚胎部分致死，致死原因主要是胚胎細胞大量擴增過程中，細胞出現明顯基因組不穩定現象，并導致胞質DNA水平顯著增加，引起較嚴重的炎癥反應。總之，該研究結果首次發現了小鼠多能干細胞復制叉上特異性功能性長非編碼RNA-Lnc956，并揭示了Lnc956維持多能干細胞基因組穩定和促進胚胎發育的分子機制。
圖1. Lnc956維持復制叉穩定促進多能干細胞基因組穩定的分子機制
該項研究以“Lnc956-TRIM28-HSP90B1 complex on replication forks promotes CMG helicase retention to ensure stem cell genomic stability and embryogenesis”為題刊發于2023年1月27日Science Advances雜志上。鄭萍課題組張偉道博士及唐敏博士研究生為該文的共同第一作者，鄭萍研究員和趙博研究員為該文的共同通訊作者。
文章鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf6277
有效清除基因組損傷的細胞個體，是干細胞維持群體基因組穩定的重要方式。p53是目前已知唯一的干細胞基因組質量監控分子。p53通過在轉錄水平上抑制多能性調控網絡關鍵基因的表達，激活分化調控網絡基因的轉錄，使PSCs快速啟動分化和凋亡，確保PSCs的基因組質量(7, 8)。除了p53通路，是否還存在其他獨立的機制調控損傷干細胞的清除，值得進一步研究。
研究團隊針對新鑒定的LncRNA-Lnc956在干細胞質量控制中發揮的作用做了深入探索。利用多種DNA損傷藥物處理、分化、凋亡、單克隆形成、克隆競爭性和轉錄組學等方法對該LncRNA功能研究后發現，缺失Lnc956的ESCs在受到DNA損傷后不易啟動分化和凋亡，提示Lnc956參與DNA損傷后ESCs的分化和凋亡。但是，Lnc956缺失的ESC中，p53通路的激活和功能未受影響，提示p53沒有介導Lnc956的調控作用。為探究Lnc956分子水平上具體作用機理，研究人員利用In vitro/in vivo?RNA pull down、蛋白質質譜及RNA免疫共沉淀等技術鑒定出與Lnc956相互作用的靶蛋白-KLF4。機制分析發現，在未受DNA損傷時，Lnc956與KLF4無相互作用。而在基因組受損后，DNA損傷反應通路的核心激酶?ATM?激活，ATM活化?Mettl3 (調控RNA m6A修飾），使?Lnc956?發生m6A修飾。發生?m6A修飾的Lnc956大量結合干性維持關鍵蛋白?KLF4。Lnc956-KLF4結合體滯留KLF4蛋白，阻止KLF4蛋白對ESCs多能性的調控，阻止其結合到DNA上行使干性調控功能，使基因組損傷的干細胞快速發生分化，得以清除。Lnc956-KLF4通路不依賴p53，和p53通路平行，共同對干細胞基因組質量進行監控。。因此，當ESCs受到DNA損傷應激時，磷酸化的ATM信號通路可分別激活p53和Lnc956-KLF4兩條通路，使未受DNA損傷修復的ESCs快速發生分化和凋亡，高效清除受損ESCs，防止其傳遞到子代，確保了ESCs遺傳物質的穩定性和安全性（圖2）。
圖2. p53和Lnc956協調調控ESCs質量控制的工作模型
該項研究以“Lnc956 regulates mouse embryonic stem cell differentiation in response to DNA damage in a p53-independent pathway”為題刊發于2023年1月20日Science Advances雜志上。鄭萍研究員和馬懷孝副研究員為該論文共同通訊作者，馬懷孝副研究員，寧雨琪博士生和王林副研究員為該論文的共同第一作者。上述兩個工作得到基金委自然科學基金（31930027）等的資助。
文章鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade9742
參考文獻
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