中國科學院過程工程研究所為多價滅活口蹄疫病毒疫苗抗原含量檢測提供新策略
多價疫苗中每種血清型的有效抗原含量是影響疫苗質量的重要因素，以往檢測技術存在無法分型和同時定量檢測等問題。近日，中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室張松平、蘇志國研究員團隊利用毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）技術，實現了對O/A雙價滅活口蹄疫病毒疫苗抗原（FMDV）中O型、A型完整病毒的同時定量檢測，作為單價和雙價FMDV疫苗質量控制的簡單、快速、可靠的工具，具有重要的應用推廣價值。相關工作發表在Journal of Chromatography A?(DOI：https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461834)。
張松平、蘇志國研究員團隊長期致力于復雜、超大生物分子的分離純化、穩定與質控新技術的基礎與應用研究工作。近年來，針對FMDV這一重要的獸用疫苗產品，基于完整病毒顆粒146S的顆粒特性，建立了高效液相凝膠過濾色譜（HPSEC）與多角度激光散射技術聯用檢測技術，實現了146S的定量、準確、快速檢測（Vaccine，2015, 33: 1143–1150）。在此基礎上，研究和創建了系列抗失活純化技術、抗原穩定關鍵技術、以及新型佐劑，系列相關工作發表在Vaccine（2017, 35：2413；2020, 38：2478；2021，38：2904）、Biochem Engin J（2017, 124: 99）、Molecular Pharmaceutics（2020, 17：2952）、J Chromatography B?（2020, 1142, 122051）、J Virology（2021，95: e02431-20）等期刊。口蹄疫滅活疫苗抗原146S含量高效液相色譜檢測法在2017年底通過了中國獸醫藥品監察所組織的專家論證，并被農業部推薦成為試行標準，目前已經在多家疫苗生產企業成功應用，為保證疫苗產品質量、開發新工藝和新劑型發揮了重要作用。
用于區分血清型的ELISA、PCR等傳統技術，存在難以區分完整顆粒與亞病毒顆粒、裂解抗原，以及技術需要特定的PCR引物的問題。HPSEC檢測技術也是基于樣品尺寸大小差異的分離技術。隨著多價FMDV 疫苗的廣泛應用，對于尺寸和分子量非常接近的不同血清型樣品（圖1），迫切需要一種能夠同時定量疫苗中不同血清型病毒抗原的準確、簡便的方法。
圖1：A型和O型FMDV的（A）電泳、（B）透射電鏡、（C）DLS粒徑分析、（D）HPSEC-MALLs分子量分析
針對上述挑戰，在HPSEC檢測技術基礎上，該研究團隊提出利用CZE對多價口蹄疫病毒疫苗抗原FMDV同時進行O型、A型完整病毒的定量檢測。CZE的分離機制主要是在外加電場存在的情況下，基于不同組分的荷質比差異進行分離（圖2A），在病毒及病毒樣顆粒等大分子生物樣品分析檢測方面具有獨特的優勢和廣闊的應用前景。
圖2:（A）CZE原理；（B）不同濃度下A型和O型抗原的Zeta電位分析
基于CZE的原理，研究人員首先通過對不同血清型FMDV的電荷分析，發現其存在較大的電荷差異（圖2B），具有采用CZE分離的理論基礎。在優化的紫外檢測波長、背景電解質、進樣量和分離電壓等檢測條件下，A型和O型146S在15-400 μg/mL濃度范圍內均表現出良好的重現性（RSD<5%）以及抗原含量對應峰面積的線性響應關系（R2=0.999）。利用不同血清型病毒粒子結構差異所導致的CZE遷移時間差異，實現了A/O雙價146S的分離及定量，相對誤差<10%（圖3A）。與HPSEC方法相比，兩種方法所得病毒總量的結果一致，但CZE檢測不同血清型病毒具有不同的保留時間，從而可以分別定量檢測；而HPSEC法則無法區分尺寸相近的兩種病毒，因此只能得出總病毒含量（圖3B）。
圖3：（A）CZE及（B）HPSEC分別用于定量檢測A型和O型單價、以及A/O雙價FMDV
CZE方法成功應用于單價和A/O雙價FMDV商品疫苗的定量檢測，可以量化成品苗中每個血清型的FMDV含量，而且不受核酸雜質的干擾。相關技術已申請國家發明專利。
生化工程國家重點實驗室生物藥物研究部蛋白質純化與制劑工程課題組
