島津成像質譜顯微鏡應用專題丨視網膜藥物分析
高分辨率成像質譜應用于大鼠視網膜中氯喹的分布分析
在藥物研發過程中，候選化合物的體內藥代動力學分析是非常關鍵的步驟。該分析不僅可以掌握其藥效藥理，還可以得到和毒性評價有關的信息。通常，使用放射性自顯影技術(Autoradiography: ARG)和熒光色素標記細胞的方法進行分析。但是，使用ARG的方法成本高，而且一方面這些方法無法區別原藥和代謝物，另一方面標記物質的行為可能與未標記物存在差異。
因此，最近成像質譜分析法，即不進行標記即可對候選化合物進行檢測的方法備受矚目。質譜成像法除了能夠在無標記的情況下對各種物質的分布進行分析，還能夠使用同一切片同時分析原藥及其代謝物，有望在今后的藥物研發領域得到應用，取得新的突破。本文為您介紹使用成像質譜顯微鏡iMScope TRIO對氯喹給藥后大鼠視網膜進行檢測的示例。
1.大鼠視網膜中氯喹的高空間分辨率成像
在本次分析中，對給予抗瘧劑藥物氯喹的大鼠視網膜進行分析。圖1為氯喹的結構式。使用氯喹標準品進行分析，對基質及測定模式進行優化，表1為組織切片的分析條件。
圖1 氯喹的結構式
表1 分析條件
使用成像質譜顯微鏡iMScope TRIO進行高空間分辨率成像，發現在約10μm厚的視網膜色素上皮周圍有氯喹的分布(圖2和圖3)。
圖2 組織切片上的MS/MS質譜圖
圖3 光學圖像和MS/MS質譜圖像
在測定氯喹時，如果使用成像質譜分析法常用的MS模式，因受到生物體衍生雜質帶來的離子抑制、干擾的影響，無法得到清晰的MS圖像(此處數據省略)。在本次分析中，通過iMScope TRIO的MS/MS模式進行測定，提高靈敏度，能夠獲得10μm的高空間分辨率下的MS/MS圖像。
2.大鼠眼球中氯喹的高速成像
在藥代動力學研究過程中，為了闡明藥物分子在細胞及器官水平的特征分布區域，分別需要在高空間分辨率及中等空間分辨率獲得藥物分子的分布信息。本實驗使用MS/MS模式測定在中等分辨率(50μm)下測定大鼠眼球整體的氯喹分布情況，分析條件如表2所示。
表2 分析條件
圖4 組織切片上氯喹的MS/MS產物離子質譜圖，激光直徑50μm
雖然使用了更大的激光直徑，有可能帶來存在噪音高、離子抑制等問題，iMScope TRIO依然能夠檢測得到具有較高信噪比的氯喹特征碎片，并獲得清晰的質譜圖像。成像質譜實驗的采集速度取決于目標檢測區域中所包含的點數。iMScope TRIO能夠獨立更改激光直徑及采集間隔等參數，從而能夠輕松控制采集速度及圖像尺寸，并且不會影響數據質量。
3.基質涂敷方式的比較
在氯喹成像質譜分析中，比較了2種不同的MALDI基質涂敷方式。圖5顯示了有升華法獲得的成像結果(基質升華方式的示意圖如圖6所示)。基質升華有iMLayer升華儀自動完成，而噴霧方式由手動完成。噴霧方式獲得成像結果如圖7所示。對比兩種方式的檢測結果，升華法獲得了更加清晰尖銳的氯喹分布圖像，而噴霧的結果則看起來會有一些擴散，如圖7所示。前處理方式的優化依然取決于組織切片的特性以及所使用的基質類型。如示例中的結果，前處理步驟對最終成像結果的圖像質量有顯著的影響，不僅僅是切片制備的條件同時基質涂敷的過程也很重要。
圖5 升華法獲得的氯喹分布質譜圖像
圖6 基質升華方式示意圖
圖7 噴霧法獲得的氯喹分布質譜圖像
4.在相同切片上進行MS和MS/MS成像分析
成像質譜分析中，在同樣位置只能采集一次數據。但是，使用iMScope TRIO可以調整激光直徑及采集間隔，因此可以在采集點之間留下未采集區域，從而實現更多次的成像分析。圖8顯示了使用激光直徑為5μm，采集間隔為10μm時，在同一采集區域內進行4次成像分析的方式。
圖8 在同一測定區域進行1次MS分析及3次MS/MS分析的數據采集設置方式示例
文獻題目
《High spatial Resolution Imaging by iMScope TRIO -Imaging of Chloroquine Distribution in Rat Retina-》
使用儀器
島津iMScope TRIO
聲明
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