檢驗標準化與量值溯源促進精準醫學診斷的實現——訪中國人民解放軍總醫院生化科主任顏光濤
[導讀] 近年來，隨著人們對醫療服務的需求不斷提升，“精準診斷”成為臨床醫生和科學家特別關注的議題。一方面，國家對“精準醫療”十分重視，精準診斷是實現精準醫療的前提;另一方面，IVD技術的進步勢必會推進精準診斷時代的早日到來。在這樣的大背景下，臨床診斷領域受到了前所未有的重視。近日，儀器信息網就精準診斷、國內IVD行業發展、檢驗醫學標準化等熱點話題采訪了解放軍總醫院生化科主任顏光濤研究員。
近年來，隨著人們對醫療服務的需求不斷提升，“精準診斷”成為臨床醫生和科學家特別關注的議題。一方面，國家對“精準醫療”十分重視，所謂 “精準醫療”，即精準診斷和精準治療，可以說精準診斷是實現精準醫療的前提;另一方面，我國體外診斷(in vitro diagnostic products，IVD)市場發展迅速，IVD行業逐漸得到資本市場的重視，IVD技術的進步勢必會推進精準診斷時代的早日到來。在這樣的大背景下，臨床診斷領域受到了前所未有的重視。
近日，儀器信息網就精準診斷、國內IVD行業發展、檢驗醫學標準化等熱點話題采訪了中國分析測試協會標記免疫分析專業委員會主任/中國人民解放軍總醫院生化科主任顏光濤研究員,旨在幫助廣大臨床工作者深入了解我國臨床診斷技術發展和應用情況。
中國分析測試協會標記免疫分析專業委員會主任/解放軍總醫院生化科主任 顏光濤
精準診斷指導個體化治療，獲得最佳治療效果和減少副作用
“精準醫療”是一個建立在了解個體基因、環境以及生活方式的基礎上的新興疾病治療和預防方法。顏光濤解釋到，“精準醫療的重點在精準，就比如打靶子，精準醫療的目標就是靠近疾病的靶心，提高準確率，降低副反應。對腫瘤患者來說，比經受多重化療‘瞎子摸象’般地診療方式更能燃起對生命的信心，通過精準診斷獲得個體化治療方案，能使患者少受抗癌之苦，甚至能為患者贏得更多生存時間和治愈機會?！?/span>
通過精準診斷，可提升早期腫瘤患者疾病確診率，獲得對病變性質的精準判斷，明確良惡性;對于中晚期癌癥患者而言，對突變基因進行檢測，可以確定治療靶點。醫生通過檢測結果，為患者量身設計個體化治療方案，使患者獲得最大的治療效果和最小的副作用，同時，也能節約醫療資源。
對遺傳性疾病的早期診斷和干預，是精準診斷的另一個重要作用。顏光濤講到，“疾病的預防其實比疾病的治療更能造福人類，精準診斷技術的長足進步將使某些遺傳相關性疾病得到很好的預防。比如：耳聾父母的基因檢測能很大程度上降低耳聾患兒的出生率，BRCA1/2基因的檢測能評估乳腺癌患者的直系女性親屬的乳腺癌發病可能性等等。”
全球范圍內IVD領域是繼臨床治療設備和藥物之后技術進步最集中區域
隨著全球經濟的發展、人們保健意識的提高以及全球多數國家醫療保障政策的完善，全球IVD行業持續發展。2016 年，全球IVD行業市場規模約為617億美元，預測未來幾年內全球IVD行業將以約5%的年均復合增長率增長，并在2020 年達到747億美元。顏光濤指出，“我國體外診斷行業處于行業生命周期中的成長階段，人口老齡化、城鎮化、人們健康意識的增強、政策的支持以及診斷技術的進步等因素都推動著行業的快速發展?！?/span>
海外歐美等發達經濟體國家的體外診斷行業經過多年的發展，在技術、產品覆蓋人群、人均消費水平等方面都大幅領先于我國。因而，通過對以歐美為主導的全球體外診斷行業的發展現狀進行分析，無疑對理解我國體外診斷行業的未來發展趨勢具有重要的參考意義。顏光濤介紹，“由于國外醫療制度較為完善，分級診療做得好，使得國外醫療檢測機構分布范圍廣、區域覆蓋面大，對先進的診斷產品和技術需求大，因此國外IVD產業發展包括市場、產品、技術都相對成熟。而目前我們國內問診人群相對比較集中，人們還是傾向于去大醫院看病。”
據了解，在我國國產IVD產品的市場份額僅占10%-15%，近90%的市場份額為羅氏、雅培等國外幾家跨國公司所占有。對于這一現狀，顏光濤給出了自己的看法，“我國IVD產業起步晚，市場分散，IVD企業少說上千家，整體技術水平和國外還有明顯差距。而對醫院和醫生來說，身上所肩負的責任使得醫生必須對產品質量，包括產品的穩定性、連續性和售后服務都有嚴格要求。在這種情況下，國產IVD企業目前這種處境也具有一定合理性。”但他相信，“隨著一批國內領先的體外診斷企業在化學發光免疫診斷領域的不斷創新和突破，在醫改的大環境及政策推動下，國產化學發光產品將率先在城市三甲醫院層面實現對進口產品的替代。”
作為一個多學科交叉、知識密集型的產業，技術進步始終是國內外IVD行業發展的重要驅動力。顏光濤講到，“全球范圍內IVD是在臨床設備和治療藥物之后非常大的技術進步集中區域?！蓖瑫r，我國IVD 行業細分領域眾多，競爭激烈，參照海外經驗，預計未來國內IVD行業市場集中度將大幅提升，積極實施外延并購的IVD細分龍頭將由此受益。
化學發光免疫分析成為臨床免疫理想的檢測技術
目前臨床開展的免疫檢測技術有免疫熒光技術、放射免疫檢測、免疫比濁技術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫金膠體技術、化學發光免疫分析技術、均相免疫分析技術。另處還有臨床PCR分子診斷、液態活檢技術等也有廣泛的臨床應用。顏主任對這些主流技術逐一作了講解。
免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體(或抗原)檢測組織、細胞或血清中的相應抗原(或抗體)的方法。由于熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此已廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。熒光檢測技術的發展，使得免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查IgM抗體，作為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的亞類。通過流式細胞儀，針對細胞表面不同抗原，可以同時使用多種不同的熒光抗體，對同一細胞進行多標記染色。
放射免疫檢測技術是靈敏度較高的檢測技術，利用放射性同素標記抗原(或抗體)，與相應抗體(或抗原)結合后，通過測定抗原抗體結合物的放射性檢測結果，具有pg 級的靈敏度，且利用反復曝光的方法可對痕量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。
酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上酶，抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來，根據酶作用底物后的顯色顏色變化來判斷試驗結果，其敏感度可達ng 水平。常見用于標記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)等。由于酶聯免疫法無需特殊的儀器，檢測簡單，因此被廣泛應用于疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS-ELISA。
膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟，該方法是將二抗標記上膠體金顆粒，利用抗原抗體間的特異性反應，最終將膠體金標記的二抗吸附于滲濾膜上，此方法簡單，快速，廣泛應用于臨床篩查。
化學發光免疫分析是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術，是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發展起來的一項最新免疫測定技術?；瘜W放光免疫分析儀繼承了放射免疫的所有優點，同時克服了放射免疫和酶聯免疫各自的缺點，是臨床免疫檢測目前較理想的方法。它在很大程度上巳取代放射免疫和酶聯免疫成為臨床免疫檢測常規技術。
標本中的抗原與試劑抗體反應后，形成結合的抗原抗體復合物和剩余的游離抗體;測定兩者之一即可計算出標本中抗原的含量。在一般情況下需將結合的(B)和游離的(F)分離后再進行測定，此為異相。在特殊情況下，B和F具有不同的特性，不必分離即可進行測定，此為均相。均相酶免疫測定包括酶擴大免疫測定技術和克隆酶供體免疫測定兩種。
應用分子生物學方法檢測患者體內遺傳物質的結構或表達水平的變化而做出診斷的技術，稱為分子診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質。分子診斷是當代醫學發展的重要前沿領域之一，其核心技術是基因診斷，常規技術包括: (1)聚合酶鏈式反應(PCR); (2)DNA測序(DNA sequencing); (3)熒光原位雜交技術(FISH); (4)DNA印跡技術( DNA blotting );(5)單核苷酸多態性(SNP);(6)連接酶鏈反應(LCR);(7)基因芯片技術(gene chip)。其中，PCR產品占據目前分子診斷的主要市場，基因芯片是分子診斷市場發展的主要趨勢。PCR產品靈敏度高、特異性強、診斷窗口期短，可進行定性、定量檢測，可廣泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、優生優育、遺傳病基因、腫瘤等，填補了早期免疫檢測窗口期的檢測空白，為早期診斷、早期治療、安全用血提供了有效的幫助?；蛐酒欠肿由飳W、微電子、計算機等多學科結合的結晶，綜合了多種現代高精尖技術，被專家譽為診斷行業的終極產品。但其成本高、開發難度大，目前產品種類很少，只用于科研和藥物篩選等用途。
隨著對腫瘤研究的深入，科學家發現在癌癥的診斷和治療過程中組織活檢技術有一定的局限性。主要表現為：腫瘤具有異質性，對于癌細胞已經發生轉移的患者而言，僅僅取某個部位的腫瘤組織，并不能反映患者的整體情況，但對所有的腫瘤組織都取樣檢測又不切實際;某些患者自身的情況決定了他不適合做組織活檢;受到手術的擾動之后，有些腫瘤有加速轉移的風險;組織活檢的滯后性對患者的治療也是不利的。因此對于癌癥的診斷和檢測技術有更高的要求。
液體活檢技術的出現，解決了上述的問題，也提前了癌癥的診斷時間。這也是液體活檢技術被《麻省理工大學科技評論》評選為“2015年十大突破技術”的原因。作為體外診斷的一個分支，液體活檢就是通過血液或者尿液等對癌癥等疾病做出診斷。其優勢在于能通過非侵入性取樣降低活檢的危害，而且有效延長患者生存期，性價比高。目前液體活檢的主要檢測物包括檢測血液中游離的循環腫瘤細胞(CTCs)，循環腫瘤DNA(ctDNA)碎片，循環RNA(Circulating RNA)和外泌體(攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質，脂類，DNA，RNA等)。其中，ctDNA，RNA和外泌體是腫瘤細胞自身分泌或死亡時釋放的物質。
中國人民解放軍總醫院生化科——亞太地區最大的臨床自動化生化免疫檢測實驗室
標準化與量值溯源是當今檢驗醫學發展的重要議題
標記免疫分析是當前生物檢測中最為活躍、覆蓋面最廣、應用最為廣泛的技術領域。是生命科學、基礎與臨床醫學、農業與環境、食品與藥物、進出口檢疫檢定、法醫與刑偵等領域的關鍵性技術支撐平臺。
標準化與量值溯源是當今檢驗醫學發展的重要議題，涉及IVD行業的各相關領域，包含復雜的技術與管理問題。顏光濤作為中國分析測試協會標記免疫分析專業委員會主任委員，一直致力于推動檢驗醫學標準化與量值溯源工作，他表示，“標準化涉及多個層面，例如設備儀器標準化、工作流程標準化、產品規格標準化、項目操作標準化、人員培訓標準化等等。標準化是一個非常系統化的工程，要求政府、企業和用戶共同推進，這也是個緩慢的過程，但是局面相當緊迫。中國分析測試協會標記免疫分析專業委員會為更好的推動我國檢驗醫學標準化與量值溯源工作，充分發揮本協會專家資源的優勢，通過建立基于我國醫學參考實驗室網絡平臺的標準化工作專家協作組(以單一項目為單位)和醫學參考實驗室協同研究組的協同研究方式，探索解決目前我國免疫類項目測量標準化的問題。首先以實現測量標準化為目的之uE3項目的協同研究為例，也希望各領域專家通力合作、相互溝通、相互理解、相互促進，在專委會這個公平、自由、開放的跨界交流平臺上碰出火花，引領我國IVD行業大踏步邁向國際?！?/span>
對于相關工作進展，顏光濤進一步做介紹，“參考體系建設是一項浩大的工程，國際的經驗是做好一個項目的標準化大約需數年時間。在楊振華教授的帶領下我國參考體系建設已取得階段性研究成果，主要表現在生化酶學、小分子代謝物項目的參考體系已經建立并在這些項目檢驗結果標準化方面發揮重要作用。免疫項目多、作用明確，標準化問題突出，臨床需求明確。蛋白類物質很重要，但標準化難度相當大。特別高興楊主任提出以uE3項目為切入點，大家用心做一定可以實現標準化，臨床作用也特別大。陳文祥主任充分肯定了標免專委會把標準化工作作為協會的核心工作之一進行重點支持的大局意識。通過‘建立多種有效的合作方式，對共同性質問題進行專題討論’的協同研究機制，相信能與當前國家對精準醫療的大力推進相互促進。提高我國精準診斷的水平?！?/span>
對于接下來的工作重心，顏光濤說，“下一步參考實驗室的重點要從生化轉向免疫項目，要總結參考實驗室建設的經驗，從uE3項目開始系統研究免疫項目標準化的路徑。希望通過多個醫學參考實驗室 ‘協同研究’的方式研制我國的參考方法，通過醫學參考實驗室網絡平臺為參考物質賦值的方式，把我國的標準物質送進JCTLM列表?！?/span>
采訪編輯：李博
顏光濤簡歷
顏光濤，男，1960年9月生，四川宜賓人。1983年畢業于華西醫科大學醫學系本科，在空軍醫專微生物免疫教研室任助教，1989年獲軍醫進修學院碩士學位，1992-1994年曾赴挪威特圖姆瑟大學作訪問學者。從1993年任解放軍第304醫院創傷研究室副研究員，已從事生化教學及科研工作20年，研究方向為標記免疫分析技術、創傷后多器官衰竭的發病機理及神經系統損傷保護。曾任解放軍總醫院基礎醫學研究所副所長、生化研究室主任，軍醫進修學院生化教研室主任。現任生化科主任，研究員、臨床檢驗教研室主任，博士研究生導師。已發表SCI收錄論著28篇，總影響因子81.7，單篇論文最高影響因子6.398，Medline收錄論文27篇，在國內統計源及核心期刊發表論文210余篇?，F任中國分析測試協會標記免疫分析專業委員會主任委員。獲軍隊科技進步二等獎3項第一作者。1996年獲解放軍總醫院首屆杰出青年基金獎，獲首屆軍醫進修學院“優秀學員獎學金”，解放軍總醫院“愛崗敬業優秀青年十佳標兵”并榮立三等功1次，總后勤部“科技新星”，2002年獲國務院政府特殊津貼，2008年總醫院首屆研究型人材，首屆解放軍總醫院十佳教師。
研究方向：
(1)標記免疫分析技術的建立和應用
已從事標記免疫分析技術的研發工作近20年，采用重組、多肽合成等方法制備Leptin、Orexin-A、Ghrelin抗原，免疫獲取單克隆和多克隆抗體，在國內首先建立了高靈敏的Leptin、Orexin-A、Ghrelin等蛋白和多肽的分析方法，并在國內率先建立了人的系列炎癥細胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和IL-10)的放射免疫、酶聯免疫分析技術。并且在科研及臨床研究中廣泛應用。
(2) 臟器損傷及炎癥反應的信號轉導機制
在臟器損傷及炎癥反應的信號轉到機制的研究方面，在全軍處于領先地位。以第一完成人先后獲得1997年、2003年及2010年軍隊科技進步二等獎。分別是1)“磷脂酶A2激活和臟器功能損傷的機理研究”，證書號：97-2-149-1;2)“磷脂酶A2和炎性細胞因子在全身性炎癥反應中的作用機理研究”，證書號：2003-2-72-1;3)“瘦素對創傷感染后多臟器功能的保護及機制研究”，證書號：2010-2-43-1。
(3) 神經系統疾病(腦缺血再灌注及神經退行性疾病)的保護及信號機制
在神經系統疾病的保護及信號機制的研究方面，正在全力研究當中，已在國際刊物上發表SCI文章4篇，最高單篇影響因子5.398，主要涉及leptin對腦缺血再灌注損傷的保護，leptin與阿爾茨海默病、帕金森癥及癲癇等神經退行性疾病的關系等方面，后續研究正在進行中。
