華人先鋒《Nature Methods》利用CRISPRi繪制遺傳互作圖譜
2013年，亓磊研究組在Cell發(fā)布論文介紹了一種基于Cas9的基因調(diào)控方法。他們將這個系統(tǒng)稱為CRISPRi，在此基礎(chǔ)上，亓磊研究組深入研究，研發(fā)出了一種可以用于繪制哺乳動物細(xì)胞中的遺傳相互作用的CRISPR干擾（CRISPRi）篩選平臺。
生物通報道：斯坦福大學(xué)亓磊（Lei Stanley Qi）教授早年畢業(yè)于清華大學(xué)，現(xiàn)任斯坦福大學(xué)生物工程學(xué)、化學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)系的助理教授，近年來他在CRISPR研究領(lǐng)域取得了一系列突破性進(jìn)展，比如第一次采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的變種技術(shù)，改變了讀取誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)基因組的方式（由此入選了生物通的2016年生命科學(xué)風(fēng)云人物）。
作為基因組靶向改造（敲除和敲入）的遺傳學(xué)手段，基因組編輯技術(shù)歷經(jīng)ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，已發(fā)展成為自20世紀(jì)70年代生物技術(shù)時代開啟以來最重要的基因工程技術(shù)。因沒有物種限制、簡單、高效，以CRISPR/Cas9為代表的基因組編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人、大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、豬、羊、水稻、小麥和擬南芥等動植物（細(xì)胞）以及細(xì)菌等微生物的基因組靶向改造，成為后基因組時代的功能基因組研究、動植物品種改良、疾病模型建立以及基因治療等不同領(lǐng)域研究與應(yīng)用的利器。
基因沉默技術(shù)。研究人員將CRISPR用于基因表達(dá)序列特異性調(diào)控的平臺，研發(fā)出了一種基于Cas9的基因調(diào)控方法。他們將這個系統(tǒng)稱為CRISPRi，并指出這種RNA導(dǎo)向的DNA識別平臺是基因組范圍內(nèi)基因表達(dá)選擇性抑制的一種簡單的新方法。
今年3月，亓磊研究組發(fā)表論文，借助于CRISPR-Cas9基因編輯方法，篩選上千個基因突變組合，尋找可以選擇性殺死癌細(xì)胞的突變，從而找到癌癥的弱點(diǎn)。研究人員設(shè)計(jì)了具有兩種導(dǎo)向RNA的CRISPR -Cas9系統(tǒng)：1）靶向一個在癌癥中通常發(fā)生突變的抑癌基因；2）靶向一個受到某種癌癥藥物破壞的基因。研究人員針對三種實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系（人宮頸癌細(xì)胞，肺癌細(xì)胞和胚胎腎細(xì)胞）中的73個基因，總共150,000種基因組合研發(fā)了這一新系統(tǒng)，然后他們檢測了細(xì)胞的生長和死亡。結(jié)果證明，這種方法能揭示超過120種新的合成致死相互作用。
在此基礎(chǔ)上，亓磊研究組深入研究，研發(fā)出了一種可以用于繪制哺乳動物細(xì)胞中的遺傳相互作用的CRISPR干擾（CRISPRi）篩選平臺。他們利用單鏈或雙鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA）池分別干擾個體基因或基因?qū)Φ谋磉_(dá)，從而靶向了107個人類細(xì)胞中的染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子，并且研究人員通過針對單個sgRNA或sgRNA對相對富集的分析，描述了遺傳相互作用的定量特征，比對了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，從而揭示了染色質(zhì)調(diào)節(jié)的功能圖。
CRISPRi技術(shù)能抑制指定目標(biāo)的轉(zhuǎn)錄，不論是編碼還是非編碼的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9（dCas9），dCas9能到達(dá)引導(dǎo)RNA指定的位點(diǎn)，但無力對DNA進(jìn)行剪切（Cell, 152:1173-83, 2013）。當(dāng)dCas9結(jié)合到基因組的時候，會阻斷轉(zhuǎn)錄機(jī)器的結(jié)合，阻止這一過程的進(jìn)行。之后改良版CRISPRi在dCas9上連接了一個來自轉(zhuǎn)錄沉默子（KRAB）的結(jié)構(gòu)域。這個大約50aa的添加阻礙了DNA伸展，使其難以得到轉(zhuǎn)錄。CRISPRi的可逆性是一種特色，不過這也限制了該技術(shù)的應(yīng)用。一些研究者正在利用KRAB結(jié)構(gòu)域讓dCas9結(jié)合得更加穩(wěn)定，以實(shí)現(xiàn)永久抑制特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄。人們可以通過這種方法研究表觀遺傳學(xué)標(biāo)記的跨代遺傳。
最新這項(xiàng)研究構(gòu)建了一個靶向參與染色質(zhì)調(diào)控的107個基因（平均每基因3個sgRNA）的單sgRNA文庫，這一文庫還包括41個陰性對照sgRNA和5個陽性對照sgRNA，前者不會靶向人類基因組的位點(diǎn)，后者則靶向已知能對細(xì)胞增殖產(chǎn)生強(qiáng)烈影響的因素。研究人員利用這一文庫生成了一個可以同時靶向基因?qū)Φ碾p鏈sgRNA文庫。將這兩個文庫轉(zhuǎn)染到HEK293-TetON-dCas9-KRAB細(xì)胞中，得到了兩個包含單個或者兩個基因干擾的細(xì)胞池，這樣再通過測序，分析細(xì)胞適應(yīng)度和定量表型讀數(shù)。
這種方法相比于相比于RNA干擾（RNAi）具有多個優(yōu)勢，比如RNAi靶向的是成熟的RNA，CRISPRi的作用是阻止轉(zhuǎn)錄的起始，因此雖然CRISPR系統(tǒng)也存在脫靶效應(yīng)，但要比RNAi少得多，因?yàn)镃RISPRi必須在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近才能發(fā)揮作用。此外比較于Cas9介導(dǎo)的基因敲除，CRISPRi敲除并不會在等位基因中出現(xiàn)異質(zhì)性，而且可以進(jìn)行獲得性功能篩選，這些都有助于后續(xù)的研究。
