綠色生物制造底盤細胞高效編輯工具研發成功
運動發酵單胞菌修復CRISPR-Cas系統造成的基因組DNA和可移動元件的損傷。華中農大供圖
近日，華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室暨湖北洪山實驗室教授彭楠課題組聯合農業農村部沼氣科學研究所研究員何明雄團隊，揭示了細菌新型DNA損傷修復系統的工作規律，并結合細菌內源性CRISPR-Cas系統，建立了綠色生物制造重要底盤微生物運動發酵單胞菌和乳酸片球菌的高效基因組編輯工具。
運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種能夠在厭氧條件下直接利用ED途徑代謝糖類產生乙醇的細菌，具有乙醇發酵速率高、乙醇耐受性好及生物安全等特點，在生物燃料應用方面具有巨大的應用價值。
課題組研究發現，CRISPR-Cas系統造成的基因組DNA損傷會被微同源介導的連接途徑（MMEJ）高效修復，并造成部分DNA缺失。而MMEJ系統修復CRISPR-Cas造成的移動元件損傷的效率很低，代表了一種切割后區別自己和異己DNA的識別模式。該成果作為封面文章發表在《遺傳學與基因組學雜志》（Journal of Genetics and Genomics）上。
在此基礎上，課題組利用內源性CRISPR-Cas系統和MMEJ途徑開發了一種適用于運動發酵單胞菌進行快速基因組編輯和必需基因鑒定的工具。該工具只需要構建一個帶有mini-CRISPR的自靶向質粒，即可實現靶基因和長片段的敲除。此外，通過改造mini-CRISPR的第二個重復序列，進一步提高了該工具的編輯效率。該成果發表在《生物燃料技術》（Biotechnology for Biofuels）上。
乳酸片球菌是飼料、醫藥目錄內的重要益生菌，廣泛地應用于乳酸和飼料發酵以及免疫調節等生產實踐和臨床治療中。課題組前期分離到一株生產性能好、益生性能強的乳酸片球菌，發現其基因組編碼CRISPR-Cas9系統。
盡管該cas9基因發生無義突變，課題組研究表明，其仍能行使核酸切割功能?；谠搩仍葱訡RISPR-Cas9系統，課題組建立了高效的遺傳操作工具，實現了高效的基因敲除、點突變和整合。利用該技術消除內源性質粒和整合超表達乳酸脫氫酶基因，顯著提升了乳酸片球菌的生長速率及乳酸生產速率。該成果發表在《應用與環境微生物學》（Applied and Environmental Microbiology）雜志上。課題組獲授權發明專利一項。該工作為益生菌合成生物學研究打下了堅實的基礎。
相關論文信息：
https://doi.org/10.1016/j.jgg.2021.02.012
https://doi.org/10.1186/s13068-021-02056-z
https://doi.org/10.1128/AEM.00948-21
